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藤黄溶栓酶对高尿酸血症肾功能损伤保护作用的研究
肾功能损伤是高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)临床最常见并发症之一，体内血尿酸产生过多或肾脏排泄尿酸减少，尿酸盐达过饱和状态而沉积于肾间质和输尿管，从而引起肾脏病变HUA肾功能损伤主要病理学改变为慢性肾间质、肾小管病变，并伴有局部炎症反应发生，近年来，HUA并发的肾功能损伤发病率呈升高趋势，男性患者多于女性，其发病隐匿，早期无明显临床症状。临床上常用的化学药物多为别嘌醇、非布司他和苯溴马隆等,通过抑制尿酸生成和促进尿酸排泄来改善尿酸代谢，但对并发的肾功能损伤尚无确切疗效。糖尿病、HUA等代谢性疾病是中医药防治的优势病种，中医药及少数民族医药对其相关并发症具有较好的临床治疗优势。藤茶，又称莓茶、龙须茶、客家白茶，由显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand. -Mazz. )W. T. Wang的嫩枝叶加工而成，具有清热解毒、活血通络的功效,主要分布于四川、贵州、湖南、湖北、广西等少数民族地区,具有药食同源之性。藤茶含有黄酮类、多糖类、酚类、氨基酸等多种活性成分，其黄酮类成分含量最为丰富，主要有二氢杨梅素、藤茶素、槲皮素、杨梅素等，其中二氢杨梅素的质量分数高达35%,被认为是藤茶发挥保健功效的重要药效物质基础。现代药理学研究表明，藤茶及其总黄酮部位具有抗氧化、降血压、调血脂、抗动脉粥样硬化、心血管保护、抗肝癌等药理作用。课题组前期通过对藤茶民族习用地区大量走访和临床实践反馈后发现，藤茶作为药食两用植物，在多个少数民族地区均有治疗痛风和慢性肾炎,但其治疗HUA肾功能损伤的作用机制相关研究较少。因此，本研究采用分子对接技术，综合藤茶总黄酮中代表性活性成分，深入探讨药物组分与尿酸生成和排泄相关蛋白靶点的相互作用，并建立腺嘌呤联合乙胺丁醇致HUA肾功能损伤大鼠模型进行验证，系统探讨藤茶总黄酮提取物对HUA肾功损伤的保护作用，以期为少数民族地区药食资源藤茶的进一步保健开发提供科学依据。近年来，由于饮食习惯和生活条件的改变，人们大量摄入高嘌呤食物，HUA患病率逐年增加，成为仅次于糖尿病严重危害人类健康的“第四高”。肾功能损伤是HUA临床最常见并发症之一，尿酸是嘌呤代谢的最终产物,尿酸的生成与排泄之间的失衡是直接诱导HUA肾功能损伤的主要原因，维持正常的血尿酸水平对预防肾脏疾病的发生发展具有重要的临床意义。藤茶作为多民族地区药食保健资源具有丰富的活性成分，其开发价值较大。XOD和ADA是尿酸生成途径中的重要靶蛋白，在嘌呤分解代谢过程中发挥着重要作用，抑制其活性可以有效控制血清尿酸水平。肾脏是尿酸排泄的主要器官自由通过细胞膜，肾小管上皮细胞上的尿酸转运蛋白URAT1、GLUT9和ABCG2参与尿酸盐的分泌与重吸收，为肾脏调节尿酸代谢的重要靶点.本研究将AGTF主要活性成分与HUA的5个潜在治疗靶点(URAT1、GLUT9、ABCG2、XOD、ADA)进行分子对接模拟，结果显示AGTF中主要活性成分二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素和藤茶素与疾病相关靶点均具有较好的结合活性，表明这些成分可能是AGTF中改善HUA及其肾功能损伤的潜在药效物质。其中，藤茶素的对接得分最高，其次是二氢杨梅素，目前对藤茶素的药理活性研究较少，而二氢杨梅素作，由于尿酸不能为AGTF的主要活性成分，除了在降血糖、调血脂、抑菌、抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、保肝护肝、免疫调节等方面具有较好的药理活性，还能够显著降低小鼠血清中尿酸水平，具有保护和治疗肾脏损伤的作用，对接结果还发现，别嘌醇与5个受体蛋白都能自由结合，其中与XOD靶点的结合能最小，表明别嘌醇与XOD的相互作用最强，与其能够抑制XOD从而减少尿酸产生的报道一致，与别嘌醇的对接结果相比，AGTF的主要活性成分与5个受体蛋白发生相互作用的可能性均高于别嘌醇，提示AGTF在抗HUA及其肾功能损伤方面具有潜在的临床应用价值，AGTF可能通过二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素和藤茶素等活性成分作用于URAT1、GLUT9、ABCG2、ADA和XOD靶点，发挥治疗HUA肾功能损伤的药效作用，体现了中药多成分、多靶点的特点。基于分子对接结果，本研究采用腺嘌呤和乙胺丁醇复合建立大鼠HUA肾功能损伤模型，通过体内实验进一步探讨了AGTF对HUA肾功能损伤的保护作用及机制。结果表明，AGTF组大鼠血清中XOD、ADA活性和尿酸、肌酐、尿素氮水平均显著降低，肾脏组织病理学改变明显减轻，表明AGTF具有较好的降低血尿酸水平、改善尿酸代谢、减轻高尿酸盐沉积对肾脏组织损伤的作用，其作用机制可能与调节尿酸盐转运蛋白URAT1、GLUT9和ABCG2表达，抑制炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6和TGF-β蛋白表达等途径有关。AGTF一方面能明显抑制URAT1、GLUT9转运蛋白的表达，阻碍肾近曲小管尿酸盐的重吸收;另一方面通过上调ABCG2转运蛋白的表达，增强肾近曲小管外侧膜上的尿酸盐转运速率，促进肾脏尿酸盐的排泄，协同降低尿酸水平、减少尿酸盐在肾小管的沉积，从而减轻肾功能损伤。过多的尿酸盐在肾脏的堆积会刺激肾小管上皮细胞，促进局部炎症反应，导致肾间质纤维化，AGTF能够显著降低大鼠肾脏中TNF-a、IL-1β、IL-6和TGF-β的蛋白表达，抑制炎症反应，保护肾功能，延缓肾脏间质纤维化。综上所述，本研究通过分子对接技术结合体内实验，发现AGFT不仅能够调节尿酸盐转运蛋白URAT1、GLT9和ABCG2的表达，降低大鼠血清中尿酸代谢相关指标水平，有效改善HUA和肾脏病理反应，同时还能抑制肾脏炎症反应，发挥对HUA肾功能损伤的保护作用。与分子对接结果一致，AGTF能够直接作用于XOD、ADA、URAT1、GLUT9、ABCG2关键靶蛋白，从而发挥其治疗作用，表明分子对接结果具有可靠性和合理性。曾运雄博士介绍：痛风是一种由于机体嘌呤代谢紊乱引发的尿酸过多或者是尿酸排泄减少，并在机体内蓄积沉淀所导致的一组代谢性疾病。随着人们生活水平的提高及饮食结构的变化，痛风发病率呈逐年上升的趋势。据保守估计，目前我国有高尿酸血症患者1. 2亿，患者人口接近总人口数的10%,其中北上广深等重点城市医院抗痛风药销售额增长率几乎每年都保持在30%以上。尿酸内源性产生约占80%,外源性产生约占20%.尿酸主要通过肾脏的排泄，以维持人体尿酸水平的正常。痛风患者血尿酸水平越高，其糖尿病、心衰、高血压、心梗以及肥胖的发生率也越高，与高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖和胰岛素抵抗等疾病的发生密切相关，是当今世界尤其是中老年男性的常见病，已成为威胁人类健康的严重代谢性疾病。中医认为痛风是风湿顽痹证，主要是外感风寒湿邪，久病邪气痹阻经络，气血津液运行受阻。多因饮食工失宜，过食肥甘厚味，湿浊内蕴，日久化热所致。痛风的发病机制，主要与湿浊、痰淤、热毒有关。对于痛风的治疗目前多采用西药为主，常用的有秋水仙碱，非甾体类抗炎镇痛药，肾上腺糖皮质激素和丙磺舒等，此类西药虽然见效快，但大多治标不本，停药后病痛很容易又复发，而且此类药物往往毒副作用比较大，除可引起胃肠道反应外，长期服用还可能导致骨髓抑制、肝细胞损害、精神抑郁、上行性麻痹、呼吸抑制等等副作用。