有这么便宜的一批蛋白吗？要说这个，你需要一个“蠕虫生物工厂”3354《科学月刊》

作者/林佳阳|台大昆虫学系硕士研究生。作者/林宇春|台大昆虫学系博士生。作者/吴跃龙|台大昆虫学系副教授。作者/黄荣南|台大昆虫学系教授。带回家的信息

为了大规模生产我们想要的蛋白质，生产疫苗、蛋白质药物、护肤品等产品，蛋白质的表现方式有很多种。而昆虫表达系统在细胞培养中成本较低，蛋白质翻译后的修饰系统接近真核生物，在生产上有优势，但仍难以供应大量市场需求。

如果能将昆虫直接作为生产蛋白质的工厂，将昆虫感染病毒后，从昆虫的体液中回收蛋白质，可以提高产量，降低生产成本，这也是“生物工厂”的概念。

寒冬往往是众多病毒快乐肆虐的嘉年华。它们潜入寒冷的天气和人的免疫力下降，并在人体内引起发烧、咳嗽、流鼻涕等症状。为了避免这种情况，很多人选择接种针对这些病毒的疫苗，但是如何快速生产出这么多疫苗来满足所有的需求呢？

传统疫苗多由蛋白质构成，需求量极高。因此，在蛋白质方面需要一种高效率、低成本的规模化生产模式，并且这种生产模式也可以应用到与蛋白质相关的其他产品上，比如蛋白质药物或护肤品，但是哪种生产模式能满足这么多要求呢？

00-1010也许你首先想到的是转基因生物(GMO)。只要我们修改生物体的基因序列，就能生产出我们需要的蛋白质。虽然这是一种可行的方式，但是从大规模生产的角度来看并不可行，因为转基因生物的创造并不是一蹴而就的，从一个完整的个体生物层面来看也是非常困难的，而且还涉及到生物体内的各种生物系统。

也许我们修改过的基因会对生物产生负面影响；或者改造后的基因序列表达效果不好，无法进行工业化大规模生产。这些潜在的因素可能使基因序列的改造难以成功和不可预测。此外，创造转基因生物的成本很高，这说明投资转基因生物所需的时间和成本对于一种特定的蛋白质来说并不划算。

随着科技的发展，我们现在对于蛋白质的表达有了更多的选择，包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统(图1)。由于真核生物和原核生物在蛋白质翻译后修饰上的差异，它们大多会将大肠杆菌和酵母的表达系统应用于原核生物的蛋白质表达。昆虫和哺乳动物的表达系统被用于在真核生物中表达蛋白质。酵母虽然是真核生物，但其蛋白质翻译后的修饰系统与原核生物接近，所以仍多用于原核生物的蛋白质表达。那么我们如何选择这些表达系统呢？

哪些方法能製造出想要的蛋白质？

真核生物和原核生物在蛋白质翻译后有不同的修饰，所以大多会将大肠杆菌和酵母的表达系统应用于原核生物的蛋白质表达；昆虫和哺乳动物的表达系统被用于在真核生物中表达蛋白质。酵母虽然是真核生物，但其蛋白质翻译后的修饰系统与原核生物接近，所以多用于原核生物的蛋白质表达。图/落基山实验室、Niaid、NIH、公共领域、维基共享资源；123RF照片由Andrew Claypool在Unsplash上拍摄；123RF)从人类的角度来说，因为人类是真核生物，所以要么选择昆虫表达系统，要么选择哺乳动物表达系统。这两种表达系统都优于昆虫。考虑到大规模生产，昆虫表达系统在细胞培养中的成本远低于哺乳动物。哺乳动物细胞培养需要大量精密昂贵的仪器和耗材，如恒温器和可以控制温度和二氧化碳浓度的细胞培养液，这使得培养哺乳动物细胞的条件非常严格。

由于生产过程的高成本，使用哺乳动物表达系统将很难大量生产蛋白质，更不用说大多数哺乳动物系统，无论是在细胞水平还是生物个体，都存在法律问题，这有助于昆虫表达系统在生产中的优势。

图一：四种不同的蛋白质表现系统

在这种情况下，究竟应该如何利用昆虫来大量生产特定的蛋白质？其实答案很简单，就是“病毒”。

病毒感染宿主细胞后，可以利用宿主细胞内的资源表达自己的基因。因此，只要将病毒基因中的部分序列改造成所需的靶蛋白序列，病毒就能产生特定的蛋白。因此，“选择哪种病毒”是昆虫表达系统中的关键。这种病毒必须具有大量表达特定基因的能力，其宿主细胞必须易于培养，才能获得最大的产量。在这么多病毒中，唯一能满足这么多条件的是杆状病毒。

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目前在昆虫表现系统上，最被广泛使用的桿状病毒是加州苜蓿夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV），属于桿状病毒科的一员，是一种双股 DNA 病毒。核多角体病毒（nucleopolyhedrovirus, NPV）能感染多种鳞翅目（Lepidoptera）幼虫，例如蝴蝶、飞蛾类幼虫，而且在病毒感染虫体后，会产生一种由「多角体蛋白」组成的结构，称为「包涵体」（inclusion body）。

我们可把包涵体想像为一个用来包裹病毒的坚硬外壳，不只能保护病毒不受到外界伤害，甚至还可以让病毒在自然环境中存续一年以上。这些能力让它成为一种具有防治潜力的生物农药，能以不使用化学农药的方式控制虫害。核多角体病毒的感染途径从鳞翅目幼虫的口器开始，当幼虫取食到含有包涵体病毒的叶片后，包涵体就会顺着幼虫的食道进入其体内，到达中肠后，包涵体的多角体蛋白结构会被幼虫中肠里的硷性肠液分解，并释放出病毒粒子。

由于病毒粒子非常细小，直径只有 250～300 奈米（nm），宽度也只有 30～60 奈米，可以直接穿过幼虫中肠的围食膜（peritrophic membrane）^〔注〕；当病毒粒子穿过围食膜后，会和中肠的上皮细胞接触并发生膜融合。此时，病毒的蛋白质外壳会在细胞内被分解，而病毒 DNA 则会被送入细胞核中，开始製造出芽型态的病毒（budded virus），这些出芽型态的病毒会在细胞裂解后进入血体腔（hemocoel）内，进一步感染其他组织和细胞，造成二次感染（图二）。在感染阶段的晚期，病毒会大量表现多角体蛋白并组装成包涵体，在虫体死亡后释出到环境中，因此多角体蛋白结构正是昆虫表现系统中的关键。

图二：核多角体病毒的感染机制

该怎么做出目标蛋白质？

由于多角体蛋白会在病毒感染晚期大量表现，所以只要将多角体蛋白序列换成目标蛋白质序列，就能靠着核多角体病毒大量製造出我们想要的蛋白质。这个概念听起来非常简单，不过步骤却有些複杂。

首先，需要準备一个複製载体（cloning vector）和一个转移载体（transfer vector），複製载体里含有我们要插入的蛋白质基因序列，并藉由聚合酶链锁反应（polymerase chain reaction, PCR）或是大肠桿菌培养的方式来大量複製；转移载体则含有多角体蛋白的启动子（polyhedrin promoter）和一个外来基因的插入位置（multi-cloning site）。之后再利用限制酶（restriction enzyme）和连接酶（ligase），我们便可以将目标基因序列插入转移载体中，形成重组转移载体（recombinant transfer vector）。

第二步要準备切除处理过，呈现线状的桿状病毒 DNA。由于切除处理过的病毒 DNA 不具活性，因此不会影响接下来转染（transfection）细胞的步骤；此外，因为它们可能也会被细胞摄入，感染与生成不含有目标序列的野生型病毒，因此先行去除病毒活性对实验成功率来说相当重要。

最后一个步骤是转染，将桿状病毒 DNA 和重组转移载体一同加进培养好的细胞中。由于重组转移载体上有桿状病毒的同源基因（homologous genes），所以当细胞摄入重组转移载体和桿状病毒 DNA 后，两者会发生同源重组（homologous recombination），使得转移载体上含有目标序列的同源片段，与桿状病毒 DNA 上同源的位置互换，形成含有目标序列的桿状病毒，也就是重组桿状病毒（recombinant baculovirus）。这些重组桿状病毒便会开始感染细胞，并表现出我们想要的蛋白质（图三）。

图三：桿状病毒表现蛋白质的步骤

❶準备複製载体和转移载体，複製载体里含有要插入的目标基因序列，再以聚合酶链锁反应或大肠桿菌培养大量複製；转移载体含有多角体蛋白的启动子，和外来基因的插入位置。之后利用限制酶和连接酶，将目标基因序列插入转移载体中，形成重组转移载体。

❷準备切除处理过线状的桿状病毒 DNA。

❸将桿状病毒 DNA 和重组转移载体一同加进培养好的细胞中。由于重组转移载体上有桿状病毒的同源基因，当细胞摄入重组转移载体和桿状病毒 DNA 后，两者会发生同源重组，使得转移载体上含有目标序列的同源片段，与桿状病毒 DNA 上同源的位置互换，形成含有目标序列的桿状病毒，也就是重组桿状病毒。这些重组桿状病毒便会开始感染细胞，并表现出我们想要的蛋白质。

将昆虫当做「生物工厂」？

以目前桿状病毒的发展来说，不论生产成本、速度还是生产线建立的难易度，都比哺乳动物的表现系统优势很多，然而它还是难以供应大量的市场需求。利用昆虫细胞生产蛋白质依然有一定的成本，若想扩大细胞培养系统也不容易，那如果我们使用整只昆虫进行蛋白质生产呢？利用病毒感染虫体后，再从虫体的体液中回收这些蛋白质，这样是否能提高产量、同时降低生产成本呢？

其实这就是所谓「生物工厂」的概念，也就是直接把昆虫当作我们生产蛋白质的工厂（图四）。和细胞相比，昆虫在培养上更加简单，操作也更为容易，不像细胞需要特别注意有无汙染的情况，也不需要无菌操作台、细胞培养液、恆温箱，以及提供细胞生长因子的胎牛血清（fetal bovine sera, FBS）等昂贵设备和耗材。以鳞翅目幼虫的寄主来说，只需要透气的塑胶容器和人工饲料就可以培养，而这些东西的成本都远低于细胞所需，加上一只幼虫个体所含有的细胞数量也远超过一个细胞培养皿，使得生物工厂这个概念成为昆虫表现系统的一个新方向。

以真核生物或是人类需要的蛋白质来说，昆虫表现系统具有许多哺乳动物的表现系统所没有的优势。以桿状病毒感染昆虫寄主、从而表现特定蛋白质的方式，不仅成本低、产量高、不受法规上的限制，也更容易设计出产业上的供应链，若是有真核生物蛋白质的需求，不妨考虑看看昆虫表现系统吧！

图四：利用虫体作为生物工厂

注解

• 〔注1〕围食膜是一种在昆虫中肠里，用来保护肠壁细胞的膜状结构，有如人类肠胃中的黏膜。

• 〈本文选自《科学月刊》第621期〉

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