如何找到可靠的抗体？做可靠的实验。

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文/曾梵楠

科学界的重大考验：过半实验无法重现

对于科学家来说，探索隐藏在一切事物中的奥秘，无论多么枯燥乏味，对同一件事重复几次，对他们来说绝对是家常便饭。研究人员可以在相同的条件下重复自己的结果，这就是所谓的重复性。再现性是指即使把同一个实验交给不同的研究团队，在相同的前提和一致的操作步骤下，也能得到相同的结果。再现性是学术研究的一个非常重要的基本原则，以获得可反复验证的实验结果，并为后续研究指引正确的方向。

然而，《自然》杂志对1500多名科学家进行的问卷调查发现，超过70%的研究人员在试图复制他人的研究时失败了！即使在自己的实验中，超过一半的人也无法做出同样的结果。

如何在激烈的学术竞争和拿第一的时间压力下保证实验结果的可信度，真的很不容易。目标是将研究成果应用于生物学的生物医学领域，包括人体，实验的重现性不能马虎。但是在生物医学领域，我们还是要面对常用的实验检测试剂3354抗体不稳定的挑战！

00-1010当病菌即将入侵人体时，我们的免疫系统并不是一盏省油的灯，会发出能识别这些坏人的抗体(也叫免疫球蛋白)与之对抗。抗体是一种Y形蛋白质，其两个分支上有称为表位(也称为抗原结合位点)的化学功能基团。每个抗体的表位可以和一个特定的抗原结合，就像一把钥匙(抗体)只能开一把锁(抗原)。抗体依靠表位结构的特异性来识别外源抗原并与之结合，阻止病原体继续感染其他细胞，同时还具有标记和刺激其他免疫反应进行抵抗的功能。抗体就像人类警察。发现被通缉的犯人后，迅速抓住他们戴上手铐限制其行动，并进一步号召其他警力打击犯罪行为。

抗体除了在免疫中发挥关键作用外，由于其与特定抗原结合的高度特异性，已成为医学和科学研究中检测蛋白质表达的有力工具，可用于诊断和研究各种疾病的信号和发病机制。例如，最近由中央研究院开发的新冠肺炎快速筛选试剂就应用了抗体与特定抗原结合的原理。

抗体的大量生产是通过给实验动物如兔或羊注射抗原，分离其血液，从血清中提取。虽然抗体因其高特异性而被广泛应用于研究中，但跨国科研机构《人类蛋白质图谱》对市场上抗体产品的检测报告发现，半数抗体未通过质量检测，存在抗体不稳定可能导致实验失败的疑问。

实验结果无法重现，也许抗体错了？还得说说抗体的交叉反应性。

由于自然界中蛋白质数不胜数，且抗体特异性高，很难保证不会遇到与目标抗原化学结构非常相似的另一种抗原，因此不能完全排除抗体识别错误导致“开错锁、锁错锁”的可能。这种抗体与非靶但相似的抗原呈脱靶结合，称为交叉反应性。在疾病的诊断中，交叉反应常常是假阳性结果的原因。当受试者没有被病毒感染时，用于检测的抗体发生反应。

抗体的交叉反应性威胁到实验结果的可靠性，这真的让科学家们很头疼。抗体不像实验室仪器。可以把它们装进袋子里，要求它们乖乖听话。我们如何验证它们的特异性？

成也抗体？败也抗体？

为了保持实验数据的质量和一致性，保证研究结果的可靠性，必须用更严格的方法验证抗体质量。由一群专注于蛋白质生物学领域的多国科学家组成的国际抗体验证工作组(IWGAC)联合发布了一份关于科学方法的指南，并就如何验证抗体的特异性、功能性和可重复性提出了五种实用的增强验证方法。

IWGAC团队认为，如果研究人员想要声称抗体适合某种应用，他们应该至少使用其中一种方法作为基准来验证抗体。这五种方法可以为抗体与靶抗原的结合提供显著的证据，同时可以评估交叉反应的概率，结合起来解释抗体的特异性和实验的可靠性。

以下是五种加强验证抗体的方法。

法：

1. 标记蛋白之表现（Expression of tagged protein）：在标的蛋白进行标记，使其在和抗体结合时会过度表现或呈现萤光，因此可以用来验证是否和抗体的讯号大小一致。
2. 正交验证（Orthogonal）：利用非抗体的独立方法对多个样本进行验证，例如侦测标的蛋白质体学的内标物，和抗体的讯号进行比较。
3. 免疫捕捉法搭配质谱分析（Migration Capture MS Validation ）：
4. 独立抗体（independent antibody） ：利用两种以上，但与同一个标的蛋白上不同位置表位结合的抗体，来进行对同一个样品的验证。
5. 基因策略（genetic validation）： 利用含有经由基因剃除或敲落标的基因片段的细胞或组织作为对照组，来验证抗体的特异性。

其中，基因策略最能直接説明基因、标的蛋白及其抗体侦测的关係，是五大方法中最严谨的验证原则。基因策略採用反证法，为了确认抗体和抗原之间的专一性，会在细胞株中剃除该抗原，再测试观察抗体的反应。这就像情人间的忠贞程度考验，如果你的情人在你不在的时候，还跟别人眉来眼去，那他的专一性可能就没那么好。

为了创造你（抗原）不在场的情况，会利用基因减弱（gene knockdown）或基因剃除（gene knockout），来降低或去除标的蛋白在细胞中的表现。

基因减弱（gene knockdown）抑制产生特定蛋白质的信使RNA， 来降低标的蛋白的出现机率，但这个状况就像你躲在旁边偷看情人的行为，很有可能被情人发现而失败。而基因剃除（gene knockout）则是比基因减弱的手段来的更为彻底，它直接将表现特定蛋白质的基因片段剪去，也就是你完全离开现场。这个方法则运用了人类从细菌对抗病毒的战略中，偷师而来的革命性技术—— CRISPR / Cas9。

过去科学家必须耗费大量时间精力，去设计可从 DNA 上截取特定基因片段的酵素，每改变标的基因，就必须重新设计一次複杂的酵素。但从细菌身上找到的 Cas9 酵素，就像一把可客製化的基因神剪，想要剪取某基因片段的话，只要订做一条与之互补的导引 RNA 交给 Cas9，便能将标的基因片段剪下，再进行基因剃除或插入工作，大大提高过程效率。

CRISPR / Cas9 可以直接从 DNA 剪除会表达标的蛋白的基因片段，使标的蛋白完全失去来到这个世上的机会，名副其实地被 K.O.（击倒）！如此一来，抗体绝无与基因剃除细胞株反应发生讯号的可能，可说是五大验证方法内，严格中的严格。

拿抗体和经过基因剃除的细胞株样品反应，理应侦测不到任何标的蛋白的表达，因此可以用来确保抗体的专一性（若有讯号，则表示存在抗体交叉反应性！）反之，使用未经处理的原型细胞株进行抗体测试时，则会出现明显的讯号。

站在科学最前沿的各种实验，面临的是许多未知的不确定性。因此研究者如何选择合适可靠的验证方法，来节省宝贵的时间与样本，便是科研工作的一大关键。

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