姜伟伦/PanSci专栏作家，故事专栏作家，udn鸣人专栏作家，前国立卫生研究院健康福利政策研究员。我喜欢虎斑、橘子、白底虎斑、三斑猫。1990年，科学家首次将mRNA注射到小鼠肌肉中，发现肌肉细胞成功地将mRNA转录成功能蛋白。但由于人体的免疫机制，外来RNA被迅速消除，更容易引起严重的炎症反应。Katalin Karik的研究小组发现，特定的核苷酸修饰可以降低免疫细胞的激活程度。如果合成的mRNA上有足够多的核苷酸修饰，细胞就不会排斥外来的mRNA，细胞就会乖乖地跟着mRNA，制造出我们的蛋白质。
去年(2020年)年底，2019年冠状病毒病(新冠肺炎)疫情临近周年之际，由辉瑞和马德纳合作研发的Moderna疫苗诞生了，其保护力令人惊叹。然而，mRNA疫苗的起源要从30多年前一位女科学家的故事说起。
图//pixabay
过于脆弱的 mRNA，被科研抛弃的孤儿
想象一下，如果我们能控制蛋白质，就能治愈很多疾病。例如，教会白细胞识别肿瘤抗原可以杀死肿瘤细胞并治愈癌症，如黑色素瘤。或者让身体自己产生正常的蛋白质，它可以替代有缺陷的蛋白质，治愈遗传性疾病，比如血友病b。
但是人体是一个厌恶外来物的组织。如果将蛋白质直接注入体内，可能会引起炎症反应。在药厂，完美模仿细胞来生产和纯化分子量复杂的蛋白质，成本太高，难度太大。我该怎么办？嗯，我们可以试着教细胞制造自己的蛋白质！
细胞就像中央厨房，遵循厨师DNA的指令，厨师DNA写出菜谱(mRNA)，然后细胞厨房根据菜谱(蛋白质)烹饪菜肴，这就是“DNAmRNA蛋白质”的过程，也就是所谓的中心教条。例如，新冠肺炎疫苗的原理是病毒蛋白出现在人体内，因此科学家可以采取两种方式，即：
让人工DNA进入细胞，如腺病毒载体技术(牛津疫苗等。).让人工mRNA进入细胞，如mRNA疫苗(辉瑞疫苗等。).mRNA疗法的第一缕曙光出现在1990年，当时科学家首次将裸露和无保护的mRNA注射到小鼠肌肉中。他们还发现，小鼠的肌肉细胞成功地将mRNA翻译成功能蛋白，这一过程持续了18个小时。然而，科学家们很快认识到这样一个事实：虽然mRNA疗法在理论上是可行的，但在实践中却有很大的障碍。如前所述，“人体是一个讨厌外来事物的组织”，它讨厌外来的蛋白质——和外来的mRNA。
因为人体不希望细菌或病毒侵入体内，所以身体有多种优秀的系统，可以随时随地清除外来RNA。例如，有丰富的核糖核酸酶(RNAse)在细胞外能分解RNA更糟糕的是，细胞的Toll样受体(TLRs)系统可以检测到可疑的RNA，并识别出这种可疑的RNA属于外源基因，因此判断细胞正在被病毒感染，因此关闭了这些RNA的翻译，这甚至会引起严重的炎症反应。人体的天然防御系统，对于mRNA治疗，不仅导致翻译效率低下，还可能对患者的健康造成伤害。
人体近乎完美的免疫系统让mRNA疗法走入冷宫，沉寂多年，直到一位女科学家的出现。
因为人体不希望细菌或病毒侵入体内，所以身体有多种优秀的系统，可以随时随地清除外来RNA。图//Giphy
降职、罹癌，依旧没有放弃的女科学家—卡林柯
1985年，30岁的匈牙利科学家Katalin Karik带着丈夫、2岁的女儿和一只用1200美元缝制的泰迪熊飞往美国，开始了研究生涯。卡林克对mRNA疗法的可行性深信不疑，并继续申请mRNA疗法项目的研究经费。但当时学术界普遍认为RNA太脆弱，RNA诱发的炎症反应太强，希望不大，所以她的计划一再被高层否决。在没有资金和研究成果的情况下，卡琳科在1995年被大学降职，同时她被诊断出患有癌症。而她老公因为签证要留在海外，只能和她千里之外。健康、职场、家庭的三重打击，考验着Karinke对mRNA疗法的信心。
匈牙利科学家Katalin Karik。图//维基百科她回忆起当时的想法：“我觉得也许是我不够聪明，不够优秀。我试着告诉自己：一切都准备好了。
了，我只需要做出更出色的实验就可以了！」而在三年后，因为共用一台影印机，卡林柯认识了研究 HIV 疫苗的同事魏斯曼（Drew Weissman），两人一同埋头研究着 mRNA 疗法。直到 2005 年，研究终于露出重大突破──他们找到不会引起发炎反应的 RNA 了！
不会引起发炎反应的关键结构？
科学家很早就发现，核苷酸（DNA 或 RNA）会活化免疫系统，引起发炎反应，但令人困惑的是，动物细胞里也有丰富的核苷酸，为什么不会活化免疫细胞呢？以 DNA 来说，直到上个世纪末，人类才发现原来 DNA 的序列和微结构，会触发特定的细胞讯号，例如 DNA 的 CpG 序列里，较少的甲基化（methylation）修饰，会活化免疫细胞的第九型类铎受体〔注一〕，研究者推测这可能是因为细胞认为此特徵符合原核生物的 DNA，因此会启动发炎反应、排除入侵者。根据此概念，团队展开了精彩的思辨和实验设计，他们假设：「既然 DNA 如此，那么 RNA 的免疫反应，会不会也受核苷酸的亚型（A、U、G、C 以外的核苷酸）与微结构影响呢？」
他们回顾文献时，发现在科学家已知的 RNA 里，核苷酸的亚型与被修饰（如甲基化）的比例，似乎随着生物演化而逐渐不同。以核醣体 RNA（rRNA）为例，哺乳动物 rRNA 里的伪尿苷（pseudouridine, Ψ）比例是细菌 rRNA 的 10 倍；而转移 RNA（tRNA，负责携带胺基酸、辨认 mRNA 的零件）在哺乳细胞有高达 25％ 的核苷酸被修饰，比例远高于原核生物；相较于毫无修饰的细菌 mRNA，哺乳动物mRNA 的 5’ 端帽（5′ cap）修饰，则有形形色色的核苷酸亚型，像是 m5C（5-methylcytidine）与 m6A（N6-methyladenosine）等。细菌和动物 RNA 微结构的差异，也让卡林柯团队能试图釐清 RNA 亚型和免疫反应之间的关係〔注二〕。
向细胞学习，天然的免疫逃避
科学家分离出细胞内不同的 RNA，分别为 rRNA、mRNA、tRNA、粒线体 RNA等，餵给免疫细胞如树突细胞（dendritic cell），并观察不同的 RNA 是否会引起不同程度的发炎反应。结果发现，哺乳细胞的 rRNA、mRNA 会诱发些微的发炎相关因子（TNF-α）；粒线体 RNA 会引起剧烈的发炎反应〔注三〕；而核苷酸修饰比例最高的 tRNA，则几乎不会活化免疫细胞。
为了确认何种核苷酸的修饰，能避免活化免疫细胞，科学家合成了多种 RNA，其中的核苷酸分别由伪尿苷、m5C、m6A 等取代，再将众多人工 RNA 和人体的树突细胞混合。结果显示，特定的核苷酸修饰，如伪尿苷等，能降低免疫细胞的活化程度。也就是说，若要打造出不会引起人体发炎反应的 mRNA 疗法，关键就在于让人工合成的 mRNA，有足量的修饰核苷酸，让细胞受器误以为这是「自己人」，然后细胞就会乖乖地照着 mRNA、做出我们心中的蛋白质了！
随后，卡林柯团队将带有核苷酸修饰的萤光蛋白 mRNA，注入小鼠静脉。他发现，若注射的是有核苷酸修饰的人工 mRNA，小鼠体内的发炎因子都远低于无修饰的组别；更重要的是，在动物脾脏里检测出高量的萤光蛋白及更稳定存在的 mRNA。动物实验的结果同样显示，核苷酸修饰 mRNA 技术，能有效降低发炎反应、大幅提高转译效率和稳定性的优势。
此刻开始，卡林柯真的做到了她当年心中所想的「更出色的实验」！即使在人生低潮时，她也没有放弃的 mRNA 疗法，逐步向治疗癌症、罕病的目标挑战。而他们做出的研究结果更在数十年后，一跃成为拯救世界、终止 COVID-19 疫情的 mRNA 疫苗。
从实验可行到正规医疗手段
卡林柯与魏斯曼的研究，帮 mRNA 疗法开启了绿灯，也吸引了更多科学家，持续地最佳化 mRNA 疗法，如：
- 提升转译效率
最佳化 mRNA 的 5’ 端帽（5′ cap）、5’－和 3’－非转译区（untranslated region, UTR）、多聚腺苷酸尾（poly-A tail）等部位，并增强 mRNA 在细胞内的稳定性和转译效率。像是在 5’ 端帽模仿真核生物的 m7GpppN〔注四〕结构，或开发新的微结构；在特定疗法设定最佳的多聚腺苷酸尾硷基长度等。这些技巧让 mRNA 在细胞内能存活更长的时间，产出更大量的蛋白质，使得在临床现场中，需要的 mRNA 量更少，大幅地增加了未来 mRNA 疗法成为正规医疗的可行性。
- 最佳化载体
儘管病毒载体，例如慢病毒（lentivirus）也能投递 mRNA，但白血球对病毒外壳的免疫反应，仍令人却步。而早期的投递技术通常使用正电脂质吸附与保护 mRNA，但它的肝脏毒性使它逐渐被弃用。目前研究单位逐渐转向改用 pH 敏感性脂质，在中性的生理环境下可保持电中性、降低毒性；当 pH 敏感性脂质被细胞吞噬，进入溶体（lysosome）后，会因 pH 值降低而重新带电，进而逃脱溶体。
而在 COVID-19 疫苗开发中，从 mRNA 疗法延伸出的 mRNA 疫苗更展现了其他技术无可取代的优异性：
- 开发／改良速度
和腺病毒载体类型疫苗，如牛津疫苗比较起来，mRNA 疫苗无须进行细胞培养和纯化病毒，整体更快速、安全；而和蛋白质类型疫苗，如 Novavax、高端疫苗比较，mRNA 疫苗能直接让细胞产出病毒棘蛋白，不需要烦恼蛋白质在剪接（splicing）、摺叠（folding）、醣化（glycation）等转译后的修饰，生产上更加迅速。从病毒基因序列公布的那天算起，莫德纳仅花了 25 天就完成了疫苗。而面对各地的变异株病毒，辉瑞疫苗表示仅需 6 週，就能完成针对变异株病毒改版的新剂型。mRNA 疗法的惊人开发速度展露无疑。
- 安全性
mRNA 在人体内分解速度快，安全性高，由于未採用 DNA，能减轻民众对于疫苗是否会插入人体基因的疑虑。
- 接近自然感染
和蛋白质类型疫苗比较，mRNA 疫苗更接近病毒自然感染细胞的过程，让细胞表面布满病毒棘蛋白，能有效刺激细胞免疫（cellular immunity）反应。
从卡林柯飞往美国那天开始，她已经在 mRNA 疗法领域耕耘数十年。谁也没想到，她当初的坚持与科学界的弃儿，至今已成了拯救世界、终结大规模传染病的关键技术，未来更可能战胜癌症、克服罕病。现在不少人都认为她的卓越表现，应得到诺贝尔奖的肯定。你认为呢？
〔注一〕被免疫系统判定疑似细菌 DNA 的 CpG 序列，由于它可以引起发炎反应，所以反倒在疫苗领域被作为佐剂使用。如国产高端疫苗，其佐剂就是使用 CpG 序列。
〔注二〕有趣的是，许多病毒（如流感、腺病毒、单纯疱疹等）的 RNA 也有大量的修饰。这此现象暗示这些病毒和人类共存极久，可能从我们的细胞偷学了这招，以更好地模仿宿主特徵，骗过我们的免疫系统。
〔注三〕粒线体是古代细菌残留在我们体内的痕迹。
〔注四〕在真核生物 mRNA 链第 1 个硷基的前方，尚有个以 3 个磷酸联结的硷基（G），被称为 5’ 端帽。若缺乏此修饰，mRNA 在细胞内会快速被降解。
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