055-79000:超越CRISPR，终于实现了所有碱基的自由转换、增删！中国大牛发明了新的重基因编辑技术，可以纠正近90%的致病变异，取得了重大科学发现。

如果说DNA是上帝创造了人的图纸，那么以CRISPR为代表的基因编辑技术就是上帝的手术刀。 但这种手术刀并不是100%准确的，这成为基因编辑技术临床应用的一大障碍。

一直以来，科学家都在寻找更好、更实用的基因编辑方法，单核苷酸编辑就是其中之一。 但是，正如这个名字所示，编辑一个碱基只能编辑一个碱基。 而且，在4个碱基的共12种变化中，只有4种可以实现，嘌呤和嘧啶之间相互转换的8种都不能实现。

但是，基因编辑的这些问题，最近被中国科学家大大改善了。 边境研究所的刘如谦将CRISPR与逆转录结合，实现了所用碱基之间的自由转换，也大大改善了编辑脱靶和插入缺失的问题。 该研究发表在Nature上[1]。 (来自sciencemag.org )

CRISPR这个名字最初指的是大肠杆菌奇怪的重复基因序列。 到2010年人们才清楚其作用，但这些序列实际上是细菌储藏的病毒DNA片段。 转录的引导RNA是与切断DNA的Cas蛋白结合，向入侵的病毒DNA中携带Cas蛋白，切断病毒DNA的细菌免疫系统。

像导向RNA Cas蛋白质这样的组合，只要改变导向RNA的序列就可以把Cas带到不同的位置，这不是基因编辑的绝佳工具吗？ 确实，CRISPR迅速成为大热的基因编辑工具，操作非常简单，生物爱好者可以自己在家完成。

但是CRISPR用于基因编辑并不完美。 近年来有研究指出，编辑CRISPR基因可能激活p53系统，最终成功编辑的可能是p53功能缺陷的潜在癌细胞！

而且常用的CRISPR/Cas9系统对指南RNA的适配要求并不严格，Cas9也有可能不遵守RNA指南而盲目切割，引起编辑覆盖，或丢失大部分编辑网站远端图片来源： pixabay.com

对于单核苷酸编辑，取消了Cas蛋白的DNA断裂功能，通过连接嘧啶脱氢酶等直接改变碱基的酶，可以在不切断DNA链的情况下进行CT相互变化、ag相互变化。 但是，在C/TA/G这样的嘌呤和嘧啶之间的转换上无能为力。

另外，单碱基编辑器中有编辑窗口，如果窗口中有几个可以编辑的碱基，编辑的选择性就会变差，也会出现偏离主题的问题。 另外，如果想插入或删除几个碱基的话，还没有避免双链断裂的方法。

但是，这些问题已经被刘如谦解决了。 他一方面对Cas蛋白质进行了修改，使其只能切断DNA双链体中的一条链。 另一方面，他还连接附加到RNA上的DNA的模板RNA，作为编辑扩展向导RNA(pegrna )，相应地向Cas添加逆转录酶，利用从模板RNA逆转录的DNA修复目标部位。

PE编辑技术的基本原理

(图源： Susanna Hamilton，Broad Institute ) ) ) ) )。

这个基因编辑系统被命名为PE。 在改进的过程中，PE1、PE2、PE3、3代编辑工具应运而生。 其中PE1和PE2只能切割一条DNA链。 PE3可以在PE2中加入sgRNA，切断非编链。提高提高了编辑效率。 关于效果，需要看实验数据说话。 PE3编辑技术示意图

研究人员首先测试了PE的单核苷酸编辑能力。 与传统的嘧啶编辑器相比，PE对编辑窗中心碱基的编辑效果较差，编辑效率不到其一半。 但是，对于编辑窗口边缘的碱基，PE3的效率是传统方法的2.7倍，意外的插入和缺失也较少。 另外，PE不影响编辑窗口内的其他同种碱基，编辑精度更高。

PE和打印机编辑器的比较也得到了同样的结果。

对于CRISPR的靶标问题，理论上，PE的编辑过程中总共需要3次碱基配对。 首先进行pegRNA中的导向序列与靶DNA对的定位，然后靶DNA与pegRNA中的一对引物序列开始逆转录，最后逆转录形成的一对DNA与靶DNA完成编辑，可以很好地避开靶

事实也是如此。 在具有16个已知CRISPR靶位点的4个基因编辑靶外测试中，PE对两靶编辑的靶覆盖率均小于0.1%，靶覆盖率最高也仅为2.2%。 与此相比，在CRISPR Cas9的基因编辑中，脱覆盖率为4.3%~60%。 PE编辑覆盖率低

其次，研究人员试图用PE修复几种常见的单基因遗传病。

镰状细胞贫血由血红蛋白基因之一的atta重排引起，导致球蛋白E6V变异。 这种重排不能通过单核苷酸编辑修复。 使用PE进行编辑修复的有效率达到58%，只有1.4%发生意外插入或缺失。

Tay-Sachs病是一种常染色体隐性遗传病，患儿常在6个月内出现大脑发育障碍，3岁左右死亡。 这是由HEXA基因中插入1个4碱基引起的，PE修复该基因异常也达33%的有效率，插入和缺失仅为0.32%。

与传统的CRISPR/Cas9切割同源重组修复相比，PE的编辑/插入缺失率约高270倍，编辑准确性为提高。 此外，由于PE的适用范围非常广泛，研究人员估计，约89%的人类遗传病基因突变可能可以用PE修正。

目前，该基因编辑技术已获Prime Medicine公司批准开发，希望该技术能尽快应用并便宜。

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参考文献：

1. ANZALONE A V、RANDOLPH P B、DAVIS J R、et al.search-and-replacegenomeeditingwithoutdouble-strandbreaksordonordna [ j ]

第一张图片来自www.science mag.org/news/2019/10/new-prime-genome-editor-could-surpass-crispr本文作者|孔劭凡

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